Обмен билирубина и его особенности у новорожденных Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Филиппов Евгений Семенович, Гомелля Марина Владимировна, Дифенбах Татьяна Ивановна

Представлен обзор литературных данных, касающихся обмена билирубина и его особенностей у новорожденных детей. Наши исследования желчных пигментов желчи методом тонкослойной хроматографии продуктов сочетания билирубина с диазотированным этилантранилатом позволили выделить в желчи у новорожденных детей свыше 10 азодипирролов. В первые три дня жизни новорожденных детей уменьшается концентрация желчных пигментов в желчи , в основном за счет глюкуроновых коньюгатов (азодипиррол S), повышается содержание азодипирролов групп а и b, косвенно указывающих на наличие холестаза. Выявлено высокое удельное содержание в исследуемой желчи азодипирррола a и b(до 8%), являющегося изомером билирубина IX-b, либо IХ-g, которые могут выводиться печенью и почками без предварительной коньюгации. Результаты исследований позволили определить коэффициенты холестаза, резервной способности и зрелости глюкуронил-трансферазной системы печени у новорожденных детей. Полученные показатели можно использовать в качестве диагностических тестов у новорожденных с различными формами гипербилирубинемии.

The bilirubin changeand its peculiarities in newborn

In the literature review the bilirubin change and its peculiarities have been present in newborn . Out examinations of the bile biliaru pigments by the thinlayer chromatography method in combination of bilirubin with dinitric ethylantranilatol revelead more than 10 azodipirrol in infants. At fist 3 days lifes newborn children decreases concentracion of bilious pigments in biles, basically to account glucuronily conjugatis (azodipirrol S), increases contens an azodlperrolis groups and, obliquely pointing to presence cholestasis.Revealled BIgh specific contents in under investigation bile azodipirrol! (before 8%), being bilirubin isomere IX-, or IX-, which are to remove a liver and buds without the preliminary eonjugation.The result of examination could determine the cholestatis coefficient,capable reserve and glucuronyl transcferase hepatic system maturity in newborn . The receiving data may, beused for diagnosis of different forms of heonate hyperbilirubinemia.

Текст научной работы на тему «Обмен билирубина и его особенности у новорожденных»

Сибирский медицинский ^JffMffiW „ 4 0

Ж VP ГАГ №1-2 январь-июнь 1997 года

УДК 61 2.648:61 6-053.31:547.937

Обмен билирубина и его особенности у новорожденных

Е.С.Филиппову М.В.Гомелля, Т.И.Дифенбах

(Иркутский государственный медицинский университет —ректор, акад. МТА и АН

ВШ проф. А.А.Майборода кафедра педиатрии 1 — зав., проф. Е.С.Филиппов).

Резюме. Представлен обзор литературных данных, касающихся обмена билирубина и его особенностей у новорожденных детей. Наши исследования желчных пигментов желчи методом тонкослойной хроматографии продуктов сочетания билирубина с диазотированным этилантранилатом позволили выделить в желчи у новорожденных детей свыше 10 азоди-пирролов. В первые три дня жизни новорожденных детей уменьшается концентрация желчных пигментов в желчи, в основном за счет глюкуроновых коньюгатов (азодипиррол в), повышается содержание азодипирролов групп а и /3, косвенно указывающих на наличие хо-лестаза. Выявлено высокое удельное содержание в исследуемой желчи азодипирррола /?х (до 8%), являющегося изомером билирубина 1Х-/3, либо IХ-у, которые могут выводиться печенью и почками без предварительной коньюгации. Результаты исследований позволили определить коэффициенты холестаза, резервной способности и зрелости глюкуро-нил-трансферазной системы печени у новорожденных детей. Полученные показатели можно использовать в качестве диагностических тестов у новорожденных с различными формами гипербилирубинемии.

Билирубин (Б) является конечным продуктом распада гемсодержащих белков, которые в значительном количестве появляются при распаде эритроцитов. Основная масса эритроцитов подвергается разрушению внутриклеточно (в макрофагах) (11). И только 10% стареющих эритроцитов разрушаются в сосудистом русле.

Связывание гемоглобина и последующий транспорт к местам его катаболизма обеспечивают плазменные белки (гаптоглобин, гемопексин, альбумин).

В плазме гемоглобин распадается на два димера ( а и (3 димер), которые необратимо связываются гап-тоглобином ( «-глобулин). В 100,0 мл плазмы гаптог-лобином связывается 50-100 мг гемоглобина (18). Комплекс гаптоглобин-гемоглобин удаляется из плазмы полностью (8). 70-95% его захватывается гепато-цитами, остальная часть — макрофагами путем пино-цитоза (8).

Повышенное поступление гемоглобина в плазму быстро приводит к истощению гаптоглобина в связи с его медленным синтезом и повышению свободно-

го гемоглобина в форме а- и ¡5- димеров. а. и /?- ди-меры свободного гемоглобина, легко окисляясь, распадаются на ферригем и глобин (30).

Дальнейшее связывание ферригема осуществляется посредством двух плазменных белков: гемопек-сином (/3-глобулин) и альбумином (4,29). В отличие от быстро истощаемого пула гаптоглобина уровень гемопексина в плазме существенно не снижается даже при значительном внутрисосудистом гемолизе, что обусловлено освобождением депонированного гемопексина и активизацией его гепатоцитами (29). При недостаточности гемопексина связывание ферроге-ма осуществляет альбумин.

Связывание белками плазмы а- и /?- димеров свободного гемоглобина и ферригема обеспечивает тем самым оптимальный захват их гепатоцитами и предупреждает возможность фильтрации их в гломеру-лах.

О превращении гемоглобина в билирубин известно свыше 100 лет (37). Классические исследования школы H.Fischer в конце 30-х годов нашего столетия показали, что естественным продуктом деградации гемоглобина является Б IX.

Недавно получены доказательства существования в организме человека поликомпонентной специальной энзиматической системы, обозначенной гемокси-геназой и обуславливающей деградацию гема (35). Эта система включает следующие компоненты: мик-росомальный белок, НАДФН-цитохром Р-450; редук-тазу, цитохром Р-450, молекулярный кислород (40).

Гемоксигеназа находится в микросомальной фракции многих тканей. Специфическая активность этой системы выше в селезенке, тогда как общее содержание ее больше в печени и надпочечниках. Гемоксигеназа также обнаружена в почках, костном мозге, макрофагах. Возрастание энзимной активности индуцируется гемом и различными другими гемсодержа-щими агентами.

Показано, что белок гемоксигеназы ориентирует гем таким образом, что последующему расщеплению подвергается а-метиновый мостик, обеспечивая тем самым сгереоспецифичность деградации гема (40). При участии НАДФН-цитохром-с-редуктазы происходит восстановление железа гема и взаимодействие его с молекулярным кислородом с освобождением гидроксильных радикалов, атакующих ¿¿--метиновый мостик и образованием гидроксигема (26). Дальнейшее окисление гидроксигема приводит к разрыву а-метинового мостика с освобождением СО и железо-

Сибирский медицинский Ж V Р Н А Л

билирубинового комплекса, который, подвергаясь гидролизу, образует железо и биливердин. Биливердин, в свою очередь, под воздействием НАДФН-биливер-дин-редуктазы восстанавливается в Б, отражая разрыв порфиринового кольца при а-метиновом мостике. Однако, если разрыв порфиринового 1Х-колыда возникает ори его метиновых связях, полученный тетрапиррол соответственно будет иметь структуру изомеров /?,у,5

В желчи три изомера Б-1Х ф,у,3) обнаруживается в количестве около 6% (19). Использование меченых предшественников тема показало, что в норме у человека в среднем 70% Б образуется на погибших, стареющих циркулирующих эритроцитов. 10% — при неэффективном эритропоэзе и 20% — из других неге-моглобиновых гемопротеидов, включающих миоглобин, цитохром и железосодержащие энзимы, в основном печеночного происхождения (6).

Термин "неэффективный эритропоэз" отражает катаболизм гема, неиспользованного для построения гемоглобина. Этот гем освобождается из нормоблас-тов в костном мозге, а также в связи с отделением части гемоглобиносодержащей цитоплазмы в процессе отщепления нормобластов от ядра (38).

Катаболизм тканевого гема в основном происходит в печени (29,38).

Введение меченого предшественника гема (гли-цин-2-С-14) и появление "позднего" пика меченого Б и между 90-150 днями отражает деградацию стареющих эритроцитов, появление раннего пика меченого Б к 4-5 дню — катаболизм неэритроцитарного (тканевого) гема.

Возможное объявление низкой растворимости Б-IХ-а впервые было предложено 1.Рой и Е.иеИит (15). Эти авторы предположили, что Б-!Х-а не является линейным тетрапирролом, как до этого было принято считать, а имеет сложную структуру с внутримолекулярными водородными связями. В водородных связях пропионовые группы центральных пирроловых колец Б и С связаны с азотом противоположных пирроловых колец (пирролов).

При использовании рентгенологического анализа кристаллического Б-1Х-а было показано, что молекула Б стабилизируется шестью внутримолекулярными водородными связями. Обширные водородные связи придают молекуле черепицеобразную структуру, в которой центральный мостик глубоко погружен в предполагаемый гидрофобный центр (10).

Через печень удаляется водорастворимый Б, дли чего необходимо нарушить стабильность водородных связей. В природе это может осуществляться конъюгацией свободного билирубина (СБ) с глюкуроновой кислотой, что затрудняет образование водородных связей между пропионовыми остатками и азотом противоположных пирроловых колец. Таким образом, структурные изменения в результате эстерификации с глюкуроновой кислотой могут объяснить, почему коньюгаты Б-1Х-а быстро экскретируются в желчь и мочу, тогда как неконьюгированные молекулы — нш.

Передвижение пропионовых групп в другие позиции, что имеет место при образовании изомеров Б-IХ'/З.уД затрудняет формирование сложных внутримолекулярных водородных связей. Последнее приводит к появлению более полярных гидрофильных соединений, Более выраженная гидрофильность соединений изомеров Б-1Х-/?,у,5 дает возможность им вы-

водится с желчью без предварительной коньгации (13).

До недавнего времени возможность геометрической изомеризации желчных пигментов ЖП игнорировалась. Однако рентгенокристаллографические исследования показали, что Б-IX-a имеет специфическую конфигурацию. По современной номенклатуре эта конфигурация называется Z-Z, в противоположность Е-Е-конфигурации, где оба мостика двойных соединений перевернуты (другие возможные конфигурации -2-Е или E-Z-изомеры, в которых перевернута только одна связь). Полагают, что изомеры Б-IX-a с Е-мости-ком не способны образовывать внутримолекулярные водородные связи, как это бывает в обычном Z-Z соединении, и, в отличие от Z-Z изомеров, не требуют коньюгации для экскреции через печень.

В настоящее время известны две фракции Б-пря-мой и непрямой, в зависимости от их реакции с диа-зотированной сульфаниловой кислотой. Исследования установили, что прямой Б существует в организме в форме коньюгированного пигмента: моноглюкуро-нидбилирубина (МГБ) и диглюкуронидбилирубина (ДГБ); и непрямой в виде неконьюгированного пигмента (СБ) (32).

Движение Б из крови в желчь включает четыре взаимосвязанных этапа (5).

Печеночный захват СБ, связь СБ со специфическими внутриклеточными связующими белками, конью-гация с помощью микромсомальных энзимов, активный транспорт коньюгатов и изомеров Б в желчь. Полагают, что Б отделяется от компонента с белком до его проникновения в печень.

Установлено, что захват коньюгированного Б значительно выше, чем неконьюгированного (33). Также было отмечено, что печеночный захват неконьюгированного Б тормозится ж'конью! ированным Б, BSP и индоцианином зеленым. Эти наблюдения исключают диффузию Б и подтверждают, что печеночный захват для коньюгированного Б подобен захвату с синусоидальной мембраной активный несуще-медиаторный транспортный процесс (16).

Поток Б между печенью и плазмой двухсторонний, Приблизительно 1/3 часть плазменного СБ, проникающего в гепатоциты, в конечном счете возвращается в плазму неизменной (7). ЖП, образуемые из пула внутрипеченочных гемопротеинов митохондрий (цитохром Р450Р5 и др. цитохромы) не выделяются в желчь, а попадают в плазу крови в неконьюгирован-ной форме. Следовательно, возрастание печеночной продукции Б может увеличить неконьюгированную гипербилирубинемию.

Процесс поглощения Б опосредован носителями, и в нем участвует множество органических анионов, исключая ЖК (17).

В цитоплазме гепатоцита методом гель фильтрации удалось изолировать две белковые фракции — белки I (лигандин) и Z (24). Белки I и Z, как полагают, являются переносчиками органических анионов, У новорожденных детей, родившихся в срок, обнаружен дефицит белка I, у родившихся преждевременно и белка Z (28).

Белок I имеет молекулярный вес 22000 и выявлен в цитоплазме гепатоцитов, клеток почек и слизистой оболочки тонкой кишки, молекулярный вес белка Z — 9000-10000; оба белка не содержат нуклеиновой кислоты (28). Наибольшим сродством (85%) эти бел-

ки обладают к Б и спосооны связываться с доугими органическими ионами гоомонами (тироксин, кортизон), лекарственными веществами (салицилаты), метаболитами (свободные жионые кислоты, метаболиты пи ровиноградной кислоты) контрастными веществами.

I- протеин вследствие его высокого сродства с Б, как считалось, обеспечивает внутрипеченочную связь Ь. Z-npoT°hh, хотя и важен для транспорта Б, как оказалось, более связан с транспортом жирных кислот (31). Высказано предположение что скооость обмена Б регулируется концентрацией этих носителей (27).

Недавно было показано, что лигандин — лишь один из пяти протеинов этого семейства, выделенных в чистом виде из печени человека Эти белки обладают энзиматической активностью тлкпатион-З-трансфера-зы (22). Полагают, что эти белки необходимы для нормального транспорта Б. Однако мало вероятно, что они ответственны за первоначальное проникновение Б внутрь клеток печени, гак как сродство Б к альбумину выше, чем к лигандину и остальным глютатион-Б-транс феоазам (7).

Экспериментально доказано, что Б переходит от ли-гандина к альбумину Последнее подтверждает нали чие другого механизма, регулирующего движение Б внутрь гепатоцита.

Лигандин и другие глютатион-Б-трансферазы могут быть ответственными за хранение, накопление и растворение Б в гепатоците, выполняя детоксицирую-щую Функцию (7). Связь с этими белками уменьшает токсический эффект различных метаболических процессов, вызванных Б,

Эти белки облегчают диффузию Б между оболочкой клетки и эндоплазматическим ретикулюмом (27) и уменьшают выход Б обратно в плазму

У человека и крыс Б в желчи в основном конькл и-рован в виде глюкуронидов (20).

Источником глюкуроновой кислоты является ури-диндиФосфоглюкуроновзя кислота, которая локализуется в центральной части цитоплазмы гепатоцита.

В настоящее время вполне определенно установ лено, что ДГБ и его образование протекает в два этапа и требует два отдельных энзима (21). На первом этапе к молекуле СБ присоединяется молекула глюкуроновой кислоты с образованием МГ"Б Катализатором этой реакции является связанный с микросомальной мембраной и ассоциированный с эндоплазматическим ретикулюмом фермент уридин-Фосфоглюкуронил трансфераза. Полученный эфир МГБ прямо экскрети-оуется в желчь или на втором этапе превращав гея в ДГБ. Доказано, что второй тип катализируется функциональным энзимом билирубин-гпюкуронид-глюкоро нозил-трансферазой, локализованной в каналикуляр ной мембране гепатоцита (21).

Синтез ДГБ пооисходит на стороне каналикуляр-ний мембраны, >боащенной непосредственно к били' арной экскреции, без внутриклеточной связи и накопления (39). Метаболическая судьба СБ, выделившегося в пооцессе этой реакции, остается неизвестной. Он либо соединяется с пигментом гемопротеинов печени, либо возвращается в центральную часть гепатоцита для повторного образования коньюганов.

Коньюгиоованный Б элименируется из клеток печени в желчные канальцы с помоЦью активного несу-щемедиаторного транспорта (161. Так же, как при зах вате, коньюгированный Б, BSP, индодианин зеленый конкурируют за билиарную экскрецию канальцевотран-спортным механизмом. Последний отличается от ме-

ханизма, вовлеченного в транспорт ЖК (5),

Экскреция Б определяется максимальной транспортной способностью гепатоцита (Тт) и %тепенью депонирования в гепатоците (5) (5).

В настоящее время показано значительное накопление в клетчатках печени как СБ в соединении с глютатион-Б-трансферазами, так и МГБ (39). Интересно, что фактически весь внутоипеченочный пул коно-югированного Б составляет МГБ Высокое сродство глютатион-Б-трансфераз к Б и его коньюгатам, видимо, ответственно за этот феномен. ДГБ синтезируется в каналикугярной мембране и непосредственно экскретируетсч в жепчь без предварительного накопления Отмечена очень тесная связь между коньюга-1(ией и билиарной экешецией Б-1Х-а (14), По мере повышения трансферазной активности увеличивалась скорость экскреции Б в желчь.

ЖК образуют "мицелляоную раковину" в желчном протоке которая, создавая градиент чистой концентрации, увеличивает поток Жк из гепатоцита в желчь (17).

В кишечник взрослы* детей главным ооразом поступает коньюгированный Б, 7Ъ% которого составля ет ДГБ и 25% МГБ (20). СБ полностью реабсорбиру ется в кишечнике, достигает печени и снова реэкск-ретируется в форме коньюгата

В кишечнике ЦГБ под влиянием кишечной флоры восстанавливается до бесцветного уробилиногена и в дальнейшем пигментированного стеркобилиноге-на-отеркобилина

В отличие от взрослых, кал новорожденных содержит небольшое количество уробилина и значительное количество СБ. Это связано с повышением активности /З-глюкуоонидаз в кишечнике новорожденных и отсутствием соответствующей бактериальной флоры, восстанавливающей Б в уроболин (25), Кишеч-ные/3-глюкуронидазы гидролизипую1 ДГБ до С1 Часть СБ, образовавшегося ь результате действия /3-глюку-оонидаз, по системе кишечно-печеночной циркуляции реабсорбируются в гонком кишечнике. Возрае тание,количества СБ § кругообороте энтерогепати-ческой циркуляции увеличивает степень неконьюги-рованной гипероилирубинемии.

Значительный поогресс в изучении билирубино-вого обмена оыл достигнут после разработки в конце 60 — начале 70-х годов бельгийских исследователей новых методов изучения ЖП (14,20 36) Исследование методом тонкослойной хооматог рафии продуктов сочетания Б желчи с диазониевой солью этилан-транилата выявили значительно оольшую гетерогенность ЖП (1,14).

Этим метолом при исследовании желчи человека, собаки, крысы определяется бол^е 10 азодипирролов. По степени нарастания полярности образовавшиеся азодипиоролы бельгийские ученые предложили обозначать буквами греческого алфавита Было выделено четыре основных группы азопигментов: а,¡5,у,8, Получены данные о коньюгации Б с альдобчуроновой псевдоальдобиуроновой и гексуоонилгексуроновой кислотами, а также с глюкозой и ксилозой (14). Иногда могут встречаться Фосфаты и тауроконьюгаты Б (34).

Из всей группы азопигментов только азодипир-рол 5 как основной глюкуроновый конькл ат гидрали-зуется (8-глюкуронидазой. В желчи взрослых людей азопигмент Б при диазотировании составляет около 75%( 13).

Сибирский медицинский ЖУРНАЛ

В наших исследованиях при хроматографии желчи новорожденных азопиррол S определялся в количестве около 50% всех азопроизводных, Для суждения о степени зрелости глюкуронирования печени нами введен новый суммарный показатель — "коэффициент зрелости", позволяющий более объективно оценить способность печени. Это отношение: 5 + / + * ' у здоровых взрослых людей более чем в два раза больше, чем у новорожденных. Недавно выявлено, что азодипирро-лы группы [3 и а представляют собой моноглюкурони-ды, которые образовались путем позиционной изомеризации из естественного 1 -0-ацил-/3-0-глюкопироку-ренозида (12).

In vivo изомеризация /3 и у тетрапирролов с образованием моноглюкуронидов Б происходит при холеста-зах. Азопигменты /3 и у в отличие от S не подвергаются гидролизу /?-глюкуронидазой. Устойчивость изомеров (3 и у к взаимодействию этого кишечного фермента предупреждает реабсорбцию ЖП из кишечника.

Как показали наши исследования, содержание позиционных изомеров группы ¡3 и у при диазотировании желчи новорожденных составляет 20% от уровня всех азопроизводных, тогда как у взрослых людей лишь около 10%.

Повышение содержания азопирролов групп ¡3 и у косвенно указывает на наличие холестаза у новорожденных. Показатель холестаза у новорожденных (отношение _^

0 + ' выявил сохранение высокого уровня хо-

лестаза до 8-10 дней жизни.

Значительный интерес представляет выявленное нами высокое удельное содержание в исследуемой желчи азопирролов /Зх (до 8%) в первые три дня жизни. К 8-10 дням жизни содержание этого азопигмента уменьшается в 2,5 раза. Азопиррол (Зх является либо изомером Б-lХ-/?, либо Б-1Х-<5 и в силу более выраженной гидрофильное™ может выводиться в желчь без предварительной коньюгации (9,13). По-видимому, это является резервным путем элиминации ЖП через печень в период временной незрелости процессов коньюгации.

У новорожденных детей с гемолитической болезнью при диазотировании желчи удельное содержание азопирролов (Зх значительно меньше по сравнению со здоровыми новорожденными детьми. В течение первых 7 дней азопигмент ¡Зх определяется только у новорожденных с легким течением гемолитического процесса. Следовые количества его обнаруживаются в ди-азотированной желчи при среднетяжелой степени гемолитической болезни. При тяжелых формах гемолитической болезни этот изомер отсутствует. "Коэффициент резерва" (отношение S//Зх на 1000) при желтухе различного генеза позволяет более объективно оценивать возможность этих резервных путей для освобождения от организма Б.

1. Гипербилирубенемия. В кн.: Неонатология. — Москва, 1995. — С.328-350. Под ред. Т.Л.Гомеллы, М.Т.Каннингама.

2. Комаров Ф.И., Иванов Л.И., Иванченко А.И. Современные представления о билирубине и методах его изучения//Мед.реф.журнал, раздел XVII -1979.№6,с,22-28.

3.Маркова И.В., Шабалов н.П. Клиническая фармакология новорожденных. — Санкт-Петербург, 1993,-С.285-301

4.Barther J.P., Boissean С., Bentata J., Borderon E. Stude de la bilirubine erythrocytceire. Appreciation du risque distere nucleare//Sem.Hop.Paris,-1983.-Vol.59,1-P.53-57.

5.Berk P.D., Berlin N I , Howe R.B. Desordes of bilirubin metabolism.-In.:Diseases of Metabolism, 7th edit,Eds,Bondup.R., Rosenberg L.Philadelphia, W.B.Sannders Co.,1974,P.825-880.

6.Berk P.O., Blaschke T.F., Scharschmidt B.F., Waggoner J.G., Berlin M.I. A new aproach to quantitation of the various sources of bilirubin in man//J,Lab.Clin.Med.-1976.-Vol.87.-P.767-780.

7.Berk P P.,Javitt M B. Hyperbilirubinemia and cholestasis//Am.J.Med.-1978.-Vol.64.-P.311 -326.

8.Bissell D.M. Formation and elimination of bilirubin/ /Gastroenterology.-1975.-Vol.69,no.2.-P. 519-538.

9 Blancaert M., Compernolle F., Leroy P.,van Houtte г.,Fevery J., Heirwegh K.P. The fate of biliribin-IX-glu-curunide in cholestasis and during storage in vitro// Biochem.J. = 1978.-Vol.171.-P 203-214.

10.Bonnett R.,Davies J.E , Hursthouse M B. Stryc-tyre of bilirubin//Nature.-Lond.-1976.-Vol.262-P.326-328.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎