Мезенхимные стволовые клетки: захват, токсичность и влияние на функциональные свойства многослойных полиэлектролитных микрокапсул

К. В. Лепик 1 , В. С. Сергеев 1 , А. Р. Муслимов 1 , Д. С. Романюк 1 , Р. Т. Михелашвили 1 , И. С. Моисеев 1 , Е. В. Попова 2 ,И. Л. Радченко 2 , А. Д. Вилесов 1 , Г. Б. Сухоруков 2, 3 , Б. В. Афанасьев 1

1 Институт детской гематологии, онкологии и трансплантологии имени Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Россия

2 Санкт-Петербургский Политехнический Университет имени Петра Великого, Россия

3 Лондонский университет королевы Марии, Великобритания

Резюме

Введение

Многослойные полиэлектролитные микрокапсулы привлекают все больший интерес как перспективное средство доставки лекарственных веществ, диагностический и исследовательский инструмент. Основными преимуществами подобных микрокапсул является контролируемый размер и форма, толщина и структура оболочек, позволяющих осуществлять контролируемую доставку содержимого посредством магнитного поля, светового излучения или ультразвуковых волн, а также легкость функционализации поверхности капсулы. В настоящий момент, мезенхимные стволовые клетки (МСК), являются одной из наиболее популярных клеточных популяций в широком диапазоне клинических и научных исследований. Однако, данные об эффективности захвата капсул, а также их влиянии на функциональные свойства клеток данного типа в настоящий момент отсутствуют.

Материалы и методы

Получение МСК из костного мозга здоровых доноров и их экспансия осуществлялась согласно стандартному протоколу. Для экспериментов использовались клетки второго и третьего пассажа. В исследование включено две основных ветви в зависимости от состояния клеток, к которым добавлялась суспензия 5 мкм PAH /PSS магнитных полиэлектролитных микрокапсул, меченых FITC. В первой суспензия микрокапсул добавлялась к адгезированным на поверхности культурального пластика клеткам в соотношении 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 . Во второй смешивались суспензии микрокапсул и МСК в тех же соотношениях. После 24 часов инкубирования, эффективность захвата оценивалась при помощи конфокальной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Морфология клеток и жизнеспособность оценивалась с использованием гемоцитометра и витальных красителей трипанового синего/пропидия йодида. Способность к дифференцировке была исследована с использованием стандартных протоколов цитодифференцировки МСК в остеогенном и адипогенном направлении. Магнитная сепарация клеток, ассоциированных с магнитными микрокапсулами производилась с использованием системы midiMACS. Адгезионные свойства МСК оценивались следующим образом: МСК ассоциированные с капсулами в соотношениях 1:5 1:10 1:20 рассевались на культуральные флаконы в концентрации 20×10 4 /cм 2 при стандартных условиях. После 24 часов инкубирования кондиционная среда удалялась, адгезированные клетки удалялись путем трипсинизации. Суспензионная и адгезионная фракции подсчитывались с использованием гемоцитометра.

Результаты

Эффективность ассоциации клеток и микрокапсул коррелируют с числом добавленных капсул и используемым методом. Средний процент клеток ассоциированных с микрокапсулами при их добавлении в адгезионную культуру 8% (при соотношении клетки/капсулы 1:1) 18% (1:3) 32% (1:10); при добавлении к МСК в суспензионной форме 90% (1:1) 98% (1:3) 99% (1:10). Одиночные клетки показывают способность к захвату до 30 микрокапсул. Меньшая часть капсул ассоциирована с клеточной мембраной, но не интернируется клеткой. После интернализации микрокапсулы диспергируются в цитоплазме, главным образом в перинуклеарном компартменте клетки. Средний процент жизнеспособных клеток после инкубации с микрокапсулами в течении 24 часов, нормализованный относительно клеток контрольной группы составили 90% (при соотношении клетки/капсулы 1:5), 85% (1:10), 83% (1:20), 5% (1:100).Клетки ассоциированные с магнитными микрокапсулами могут быть с высокой эффективностью изолированы при помощи рутинных методов магнитной сепарации. Способность МСК остеогенной и адпиогенной дифференцировке значимо не изменилась с захватом микрокапсул. Анализ адгезионной активности продемонстрировал что адгезионная фракция значимо уменьшалась с увеличением соотношения клеток и микрокапсул. Средний процент адгезионных клеток составил 85% в группе (1:5), 64% (1:10), 38% (1:20) по сравнению с 85% в контрольной группе.

Выводы

Полиэлектролитные микрокапсулы могут быть захвачены МСК с высокой эффективностью. Оптимальные условия для захвата микрокапсул – клеточная суспензия. Полиэлектролитные капсулы демонтрируют незначительную цитотоксичность и влияние на клеточные функции при умеренном соотношении клетки:микрокапсулы (<1:10). Критическое снижение жизнеспособности клеток наблюдалось только к группе крайне высокого (1:100+) соотношения. Способность МСК остеогенной и адипогенной дифференцировке значимо не изменилась с захватом микрокапсул. Адгезионная способность МСК снижалась в зависимости от дозы добавленных микрокапсул. Захват большого числа микрокапсул снижает адгезионные способности МСК. Полиэлектролитные микрокапсулы – перспективный инструмент доставки клеток и лекарственных средств, с возможностью внешнего контроля посредством магнитного поля.

адгезия, дифференцировка, микрокапсулы полиэлектролитные, интернализация, мезенхимные стволовые клетки